서 론
콩을 이용한 대표적인 발효식품으로는 간장, 된장, 청국 장 등 장류로서 원료콩과 발효조건에 따라 발효특성이 달 라지므로, 맛과 향 등 품질에 중요한 영향을 미치게 된다 (Lee et al., 2015;Shin et al., 2020). 이러한 콩 발효제품 은 발효과정에서 미생물이 생성하는 효소들에 의해 당질이 나 단백질이 분해되어 소화흡수율이 향상되며, 원료콩 보 다 면역기능, 항산화, 혈전용해, 항돌연변이, 항암 등 생리 활성에 더 효과적인 것으로 보고되고 있다(Cho et al., 2000;Joo & Park, 2010;Han et al., 2015). 또한, 콩의 이 소플라본은 여성의 노화 방지와 폐경기 여성의 갱년기 증 상에 효과적이며, 특히 식물성 에스트로겐으로 알려져 있 어 갱년기 완화 관련 다양한 생리활성을 나타내는 비배당 체인 daidzein과 genistein 함량이 높은 것으로 보고되고 있 다(Bae et al., 2008;Kang et al., 2003;Kim et al., 2005).
검은콩(Glycine max [L.] Merr.)은 전 세계적으로 널리 재배되고 소비되는 작물중의 하나로 단백질, 식이섬유, 이 소플라본, 안토시아닌, 사포닌, 레시틴 등의 생리활성 물질 을 함유하고 있어 건강 기능성식품의 소재로 널리 이용되 고 있다(Kim, 2006;Chen et al., 2013). 이러한 검은콩의 유용성분은 항산화, 항암, 비만억제, 심혈관질환 등의 다양 한 효과가 연구되었다(Myung & Hwang 2008;Kim et al., 2008;Joo & Park 2010;Lee et al., 2018). 이에 따라 최 근 블랙푸드에 대한 열풍과 함께 검은콩에 대한 생리활성 효능이 알려지면서 산업체 및 소비자들의 관심이 더 높아 지고 있다. 검은콩에 대한 연구로는 여성의 산화 스트레스 감소로 혈관기능 향상(Joo & Park 2010;Yamashita et al., 2020), 항산화 효과(Peng et al., 2017), 검은콩의 안토시아 닌이 내장지방 감소로 비만개선(Lee et al., 2016), 검은콩 의 생리활성(Hwang et al., 2013) 등이 보고되었으며, 검은 콩 발효물에 대한 연구로는 주로 다양한 균주를 접종하여 제조한 발효물의 품질특성(Chen et al., 2013;Hwang et al., 2013)이 보고되었고, 버섯 균사체 이용 검은콩 발효물 의 기능성(Kim et al., 2017), 검은콩 발효물의 혈전용해능 (Joo & Park 2010)등 보고되기도 하였지만 아직 미미한 실정이다.
본 연구에서는 산업체에서 건강기능성 콩 발효제품을 개 발하는데 기초 자료로 활용하고자 생리활성이 우수한 검은 콩을 이용하여 발효물을 제조한 후 항산화성, 이소플라본, 유기산, 휘발성 향기성분 등의 특성을 조사하였다.
재료 및 방법
시료 및 검은콩 발효물 제조
실험에 사용된 원료콩은 청자3호(Cheongja-3, Miryang, Korea), 청자4호(Cheongja-4, Miryang, Korea) 및 소청자 (Socheongja, Miryang, Korea) 3종으로 국립식량과학원(경 남 밀양)에서 2018년 수확한 것을 제공받아 사용하였다. 균주는 단백질 분해능이 우수한 Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2을 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC, Jeonju, Korean)로 부터 분양받아 사용 하였다. 검은콩 발효물 제조는 300 g의 콩을 15시간 동안 수침한 다음 autoclave (BF-60AC autoclave, Biofree Co., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 121°C에서 30분 동안 증 자하였다. 증자된 콩을 무균조건에서 40°C 이하로 시킨 다 음 미리 배양된 Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2 (OD: 0.5, 108 CFU/g)를 콩 무게의 1%(v/w)를 접종하였다. 이것 을 잘 혼합한 다음 스티로폼 상자(21×27×14 cm)에 담아 온도가 37°C, 습도가 70%인 발효실에서 24시간 배양하여 검은콩 발효물을 제조하였다(Lee et al., 2014).
품종별 검은콩의 수침시간에 따른 수분흡수율
품종별 검은콩의 수분흡수율 측정은 각각의 시료를 5 g 씩 시험관에 넣은 다음 증류수 45 mL를 넣고 즉시 항온기 에 넣었다. 각각의 시료를 수침시간별 1, 3, 5, 7, 9, 12, 17 및 24시간 수침을 유지하였으며, 수침수의 온도는 항온 기 안에서 25°C로 유지하면서 실험을 진행하였다. 이것을 수침 시간별로 시험관을 꺼내어 물을 제거한 다음 여과지 로 표면의 물기를 제거하여 무게 증가비율로 수분 흡수율 을 아래의 식으로 계산하였다(Shin et al., 2019).
품종별 검은콩 발효물의 항산화 활성
품종별 검은콩 발효물의 총 폴리페놀 함량 측정은 Singleton et al. (1999)의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu법으 로 측정하였다. 시료 추출물 100 μL에 2% Na2CO3 2 mL 를 가하여 혼합한 후 3분 동안 방치하였다. 여기에 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich) 100 μL와 Na2CO3 용액을 첨가한 다음 30분 동안 상온에서 방치한 후 750 nm 에서 흡광도 측정하였다. 표준물질로 gallic acid (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 검량선을 작성 하였고, 이로 부터 총 폴리페놀 함량을 계산하였다. 총 플 라보노이드 함량은 Amerinem & Ough (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 25 μL에 증류수 100 μL와 5% NaNO2 7.5 μL를 넣은 다음 5분간 방치하였다. 이후 10% AlCl3·6H2O 15 μL를 넣고 6분 동안 방치한 다음 1 M NaOH 50 μL 첨가한 후 11분 후에 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 (+)-catechin hydrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
품종별 검은콩 발효물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 에 의해 생성된 free radical 전자공여작용(electron donating ability, EDA) 측정은 Blois (1958)의 방법을 참 고로 측정하였다. 추출물 0.2 mL에 0.2 mM DPPH 용액 (99.9% ethanol에 용해) 0.8 mL를 첨가한 다음 vortex mixer 로 10초 동안 진탕하고 30분 후에 분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 525 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 이때 전자공여능은 시료 첨가구와 비첨가 구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 계산하였다. 총 항산화력 은 ABTS radical 소거능으로 측정하였다(Leong & Shui 2002). 즉, ABTS (2,2'-Azino-bis-3-ethylbenzo-thiazoline-6- sulfonic acid) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 7.4 mM과 potassium persulphate 2.6 mM을 하루 동안 암소에 방치한 다음 735 nm에서 흡광도 값이 1.4-1.5가 되도록 물 로 희석하였다. 희석된 ABTS용액 1 mL와 추출액 50 μL를 첨가한 후 30분 방치한 다음 흡광도를 측정하였다. 표준물 질로서 L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 동량 첨가하였고, 총 항산화력은 AEAC(L-ascorbic acid equivalent antioxidant capacity, mg AA eq/g sample) 로 하였다.
품종별 검은콩 발효물의 이소플라본
검은콩 발효물의 이소플라본 함량 분석은 Wang et al. (1990)의 방법을 참고로 하였다. 시료 2 g에 acetonitrile 24 mL와 1M hydrogen chloride 6 mL로 실온에서 1시간 추출 하여 여과(Whatman No. 2, Whatman, Clifton, NJ, USA)한 후 증류수로 2배 희석하였고, 0.22 μM membrane filter로 filtration 시켜 ultra performance liquid chromatography (UPLC, Waters Co., Milford, MA, USA)로 분석하였다. Column은 ACQUITY UPLC?HSS C18 column (1.8 μm, 2.1×75 mm), 이동상은 0.1% acetic acid를 함유한 10% 메 탄올(용매 A)과 0.1% acetic acid를 함유한 메탄올(용매 B) 을 사용하였다. 용매 gradient는 용매 B의 농도를 17분간 26%에서 50%로 증가시켰고, 유속은 0.3 mL/min, 주입량은 0.8 μL, UV detector (254 nm)로 검출하였다.
품종별 검은콩 발효물의 유기산
품종별 검은콩 발효물의 유기산 함량은 Lee et al. (2014)의 방법을 참고로 하였다. 시료 1 g에 증류수 10 mL를 첨가하여 1시간 초음파(Sonicatior, BKUP-600N, Biokonvision)처리한 다음 0.22 μm membrane filter (Merck Millipore)로 여과한 것을 시험용액으로 하였다. 유기산 분석 은 HLB Sep-pak C18 cartridge (Waters Co., USA)에 통과 시킨 후 HPLC (Dionex Ultimate 3000, pump, autosampler, USA)로 분석하였다. 사용된 column은 Aminex 87H (300 mm×6.5 mm, Waters Co., USA)이었으며 mobile phase는 0.01N sulfuric acid이었다. Injection volume은 10 μL, flow rate는 0.5 mL/min로 하여 UV detector (Shodex RI-101, RefractoMAX520, Japan)로 검출하였다. 표준물질로는 citric acid, lactic acid, fumaric acid, succinic acid 및 acetic acid (Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
품종별 검은콩 발효물의 휘발성 화합물
품종별 검은콩 발효물의 휘발성화합물 분석은 GC/MS (TRACE1310, Thermo, USA, TSQ8000, Thermo, USA)를 이용하였다. 휘발성 화합물의 향기성분 포집은 SPME (solid phase micro extraction)방법으로 하였고, fiber는 carboxen/polydimethylsiloxane fiber (CAR/PDMS, 75 mL, Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 코팅된 것을 이용하였다. 향을 포집한 후 injector에서 5분 동안 정치시킨 다음 NIST library (Mass spectral program, version 4.5, USA)를 함께 이용하였다. 사용된 컬럼은 DB-WAX 컬럼(Agilent 60 m×0.25 mm, 필름 두께 0.5 μm)이었으며, injector의 온도 는 240°C이었고 질량 선택적 검출기의 계면온도는 250°C 로 하였다. GC/MS로 얻은 mass spectrum을 Wiley 275 data base로 library search한 결과를 이용하여 동정하였다 (Park et al., 2017).
통계처리
본 실험 데이터는 SPSS 시스템(Statistical Pack-age for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) soft-ware package (version 12.0)를 이용하여 평균과 표준편차를 산 출하였다. 평균값은 one-way analysis of variance (ANOVA) 로 비교 분석하였으며, Duncan's multiple range test에 의 하여 p<0.05 유의수준에서 평균 간 다중비교를 실시하여 검정하였다.
결과 및 고찰
품종별 검은콩의 수침시간에 따른 수분흡수율
품종별 검은콩 발효물 제조 시 원료콩의 수침시간을 결 정하기 위하여 수분흡수율을 측정한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같았다. 원료콩의 수분흡수율은 1, 3, 5, 7, 9, 12, 17 및 24시간 동안 시간별로 측정하였는데, 모든 품종에서 수 침 시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 보였다. 모든 품종에서 수침 5시간까지는 급격히 증가하다가 그 이후 완 만하게 증가하는 경향으로 나타났다. 수분흡수율이 평형을 이루는 시간은 청자3호와 소청자의 경우 12시간 전후이었 고 청자4호는 17시간 전후로 나타나 다른 품종에 비해 수 분흡수속도가 느리게 나타났다. 이는 수분흡수속도가 느린 콩은 종피의 성분 중 칼슘 및 조섬유 함량이 더 높았다고 한 보고(Seio, 1976)가 있어 콩의 수분흡수율 차이는 품종, 저장방법 등에 의한 화학적 성분과 종피율에 따라 다른 것 으로 사료된다(Shin et al., 2019). 수침 12시간 기준으로 품종별 검은콩의 수분흡수율은 청자3호가 129.87%로 가장 높았고 그 다음으로 소청자가 126.76%, 청자4호가 110.66% 수준이었다. Shin et al. (2019)은 장류용 콩의 수분흡수율 이 수침 3시간까지 급격히 증가하다가 수침 12시간 전후 로 완만하게 수분평형을 이루었다고 하였으며, Chu et al. (2014)의 보고에서 콩의 수침 2시간에 수분흡수율이 가장 급격히 증가하였고 16시간 전후에 수분평형을 이루었다고 하여 본 실험의 결과와 유사한 경향이었다.
품종별 검은콩 발효물의 항산화 활성
Table 1는 품종별로 제조한 검은콩 발효물의 총 폴리페 놀과 플라보노이드, DPPH와 ABTS racdical 소거능 등의 항산화성을 측정한 결과이다. 일반적으로 원료콩 보다 콩 을 발효하였을 때 항산화 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다(Joo & Park 2010;Lee et al., 2016). 검은콩 발효물 의 항산화 활성은 품종별로 다르게 나타났는데, 총 폴리페 놀 함량은 청자3호 발효물의 경우 473.41 mg gallic acid equivalent (GAE)/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 플 라보노이드 함량은 소청자 발효물이 17.72 mg catechin equivalent (CE)/g로 가장 높았고 청자4호 발효물이 11.50 mg (CE)/g로 가장 낮은 함량을 나타내었다. 기 보고된 연 구에서 검은콩인 서리태 청국장의 총 폴리페놀함량은 403.58 mg (GAE)/g이라고 보고(Joo & Park 2010)하여 본 실험과 유사하였다. 또한, Kim et al. (2017)은 쥐눈이콩 발효물의 총 플라보노이드는 32.7 mg (CE)/g으로 본 실험 과 차이가 있었다. 이러한 차이는 미생물 균주의 특성과 품종 및 온도 등의 발효조건에 따른 효소활성에 의해 항산 화성이 다르게 나타난 것으로 사료된다. DPPH와 ABTS racdical 소거능은 Table 1에서 보는 바와 같이 항산화 성 분인 총 폴리페놀과 플라보노이드와 비슷한 양상으로 청자 3호 발효물이 높은 활성을 나타내었다. 앞서 총 폴리페놀 함량의 결과와 ABTS racdical 소거능 결과와의 유사한 경 향을 보였다. Kim et al. (2017)은 검은콩 발효물의 항산화 활성의 상관성을 분석한 결과 총 폴리페놀과 ABTS racdical 소거능의 항산화 활성간의 유의적인 상관성을 확 인하였다고 하였다(Kim et al., 2017). 이러한 검은콩 발효 물의 항산화성 결과로 항산화성이 우수한 검은콩 발효물의 품종 선택과 산업체에서 기능성식품으로서 이용가능성을 제시 할 수 있을 것이다.
품종별 검은콩 발효물의 이소플라본
품종별 검은콩 발효물의 이소플라본을 분석한 결과는 Table 2에 나타내었다. 검은콩 발효물에 함유된 이소플라본 은 비배당체인 daidzein, genistein, glycitein 3종류와 배당 체인 daidzin, genistin, glycitin, 각각의 배당체인 malonyl 화, acetyl화 배당체 등 12개의 종류가 확인되었다. 비배당 체의 총 함량은 품종별로 각각 대립종인 청자3호가 40.85 μg/g, 청자4호가 41.97 μg/g이었고 소립종인 소청자가 34.30 μg/g으로 나타나 대립종 보다 소립종이 낮은 함량을 나타 내었다. Shon et al. (2001)은 검은콩 청국장의 이소플라본 의 함량을 측정한 결과 비배당체 중 daidzein 보다 genistein 함량이 높았으며 소립종에 비해 대립종으로 제조한 청국장 에서 이소플라본 함량이 높았다고 한 보고와 본 실험의 결 과와 유사하였다. 또한, 콩을 발효하였을 때 이소플라본이 증가는 발효과정 중 daidzein과 genistein을 함유한 배당체 이소플라본류에서 당류 부분이 분해되기 때문이라고 하였 다. 일반적으로 이소플라본은 glycosided 형태(malonyl-, β- 및 acetyl-)의 이소플라본 이성질체와 비배당체 형태로 존 재하는데 콩의 수침 및 가열 등 가공처리에 의해 용출된 β-glycosidase의 작용에 의해 비배당체로 전환되는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2016). 따라서, 본 실험에서 검은 콩 발효과정 중 미생물이 가지고 있는 β-glucosidase에 의 한 배당체가 가수분해 되는 정도가 다르기 때문에 품종별 로 이소플라본 함량의 차이가 있는 것으로 사료된다.
품종별 검은콩 발효물의 유기산
품종별 검은콩 발효물의 유기산 함량을 측정한 결과 Table 3과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 acetic acid, citric acid, fumaric acid 및 lactic acid 4종이 검출되었다. 유기산 함량은 청자4호 발효물이 가장 많이 검출되었으며 유기산 중 citric acid가 가장 높은 함량을 나타내었다. Gil et al. (2016)은 청국장의 유기산 함량은 미생물 접종 균주와 상 관없이 lactic acid가 가장 높은 함량을 나타내었다는 보고 와 Youn et al. (2002)의 연구에서 장류용 콩을 이용한 청 국장의 주된 유기산은 acetic acid가 가장 많이 검출되었다 는 보고와는 본 실험의 결과와 다른 양상을 보였다. Oh et al. (2003)은 원료 콩에는 유기산 중 citric acid가 많이 함 유 되어 있지만 발효과정에서 미생물의 에너지원으로 이용 되면서 급격히 감소되고 lactic acid는 내염성 젖산균에 의 해 생성되고, acetic acid는 Bacillus sp.의 작용으로 증가되 는 것으로 보고되었다. 이러한 차이는 장류용콩 발효물 보 다 검은콩 발효물의 안토시아닌으로 인해 미생물의 에너지 원 이용이 달랐던 것으로 보인다. 또한, 콩 발효물의 유기 산 함량의 차이는 콩 품종 및 발효조건, 발효미생물 분포 의 차이에서도 기인되는 것으로 생각된다.
품종별 검은콩 발효물의 휘발성 화합물
품종별 검은콩 발효물의 휘발성 화합물을 SPME를 이용 하여 GC/MS로 분석한 결과는 Table 4에서 보는 바와 같 았다. 콩 발효물의 휘발성 화합물은 발효과정에서 미생물 에 의한 효소, 아미노산, 지방산, 유기산 및 당류 등의 성 의 휘발성 화합물은 총 34종이 검출되었는데, alcohol 7종, acid 7종, ketone 7종, phenol 5종, ester 2종, furan 1종, pyrazine 4종 및 miscellaneous 1종으로 동정되었다. 가장 많이 검출된 휘발성 화합물은 2,3-butanediol-R-이었으며 그 다음으로 acetoin, styrene, maltol 순으로 나타났다. 콩 발효물이나 청국장 등의 불쾌취로 알려진 butanoic acids는 모든 발효물에서 소량 검출되었는데, 기 보고된 연구와 비 슷하였다(Choe et al., 1999). 특히, 콩 발효물의 휘발성 화 합물 중 pyrazine류는 amino-sugar 반응에 의해 생성되는 것으로 가열에 의한 아미노산 열분해, 당과 단백질의 반응 으로 생성되는 휘발성 화합물로 식품의 향에 중요한 역할 을 하는 것으로 알려져 있다(Choe et al., 1999;Park et al., 2017). 본 실험의 결과에서 검출된 휘발성 화합물 중 pyrazine류는 2,5-dimethyl pyrazine, 2,6-dimethyl pyrazine, tetramethyl-pyrazine, trimethyl-pyrazine 등 4종이었으며, 품 종별로는 청자3호 발효물이 9.47%, 청자4호 발효물이 5.78%, 소청자 발효물이 1.55% 순으로 높게 나타났다. 이 는 기 보고된 Park et al. (2017)의 연구에서 콩 발효물의 휘발성 화합물은 특이적으로 pyrazine 화합물이 검출되었 다는 보고와 본 연구 결과가 비슷한 경향을 확인되었다. 따라서, 콩 발효물의 휘발성 화합물은 콩 품종, 발효환경 및 분석방법에 따라 휘발성 화합물의 조성과 함량의 차이 가 나타나며 맛과 향 등 품질특성에 대한 연구가 구체적으 로 이루어진다면 콩 발효제품의 품질향상 및 개선이 이루 어질 것으로 사료된다(Shin et al., 2019).
요 약
본 연구에서는 생리활성이 우수한 검은콩을 이용하여 발 효물을 제조한 후 항산화성, 이소플라본, 유기산, 휘발성 화합물 등의 특성을 조사하였다. 원료콩의 수분흡수율은 모든 품종에서 수침 시간이 경과함에 따라 증가하였으며, 수분흡수율이 평형을 이루는 시간은 12-17시간 전후로 나 타났다. 항산화 활성이 높은 시료는 총 폴리페놀의 경우 청자3호 발효물(473.41 mg GAE/g), 플라보노이드은 소청 자 발효물(17.72 mg CE/g)으로 나타났다. DPPH와 ABTS racdical 소거능도 비슷한 양상으로 청자3호 발효물에서 높 은 활성을 보였다. 이소플라본은 비배당체인 daidzein, genistein, glycitein 3종류와 배당체인 daidzin, genistin, glycitin, 각각의 배당체인 malonyl화, acetyl화 배당체 등 12개의 종류가 확인되었다. 비배당체의 총 함량은 소청자 발효물이 가장 낮았다. 유기산 함량을 acetic acid, citric acid, fumaric acid 및 lactic acid 4종이 검출되었고 청자4 호 발효물이 가장 높았다. 휘발성 화합물은 alcohol 7종, acid 7종, ketone 7종, phenol 5종, ester 2종, furan 1종, pyrazine 4종 및 miscellaneous 1종 등 34종이 동정되었으 며 2,3-butanediol-R-화합물이 가장 많이 검출되었다. 불쾌 취로 알려진 butanoic acids화합물은 모든 발효물에서 소량 검출되었다. 본 실험의 결과로부터 콩 발효제품의 품질 향 상 및 개선을 위하여 용도에 맞는 생리기능성 물질 및 향 미특성을 고려한 품종을 선택 한다면 고 품질 기능성식품 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.