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ISSN : 1226-4768(Print)
ISSN : 2288-1247(Online)
Food Engineering Progress Vol.23 No.3 pp.223-228
DOI : https://doi.org/10.13050/foodengprog.2019.23.3.223

Brewing Characteristics of Wickerhamomyces anomalus SC-1 Isolated from Korean Traditional Nuruk

Jin Hoon Choi, Gye Won Kim1, Hee Yoon Lee2, Cheon Seok Park2, Jae-Yong Shim*
Department of Food & Biotechnology and Global K-Food Research Center, Hankyong National University
1Brewing Research Center, Hankyong National University
2Department of Food Science and Biotechnology, Kyung Hee University
Corresponding author: Jae-Yong Shim, Department of Food & Biotechnology and Global K-Food Research Center, Hankyong National University, 327 Jungang-ro, Anseong-si, Gyeonggi-do, 17579, Republic of Korea Tel: +82-31-670-5158; Fax: +82-31-670-5159 E-mail: jyshim@hknu.ac.kr
August 13, 2019 August 20, 2019 August 20, 2019

Abstract


The brewing and sensory properties of Korean traditional alcohol beverage are greatly influenced by yeast acting as alcohol fermentation microorganism. Therefore, this study investigated the brewing characteristics of Wickerharmomyces anomalus SC-1, non-Saccharomyces cerevisiae isolated from Korean traditional Nuruk. Ipguk and Nuruk were used for fermentation agents. Alcohol content was not significantly different between SC-1 and S. cerevisiae widely used in the market. Fermentable sugars were consumed more rapidly in the case of W. anomalus SC-1 than S. cerevisiae. Acidity in Ipguk treatment was higher than that of Nuruk throughout the fermentation period regardless of types of yeast. Citric acid was major organic acid in Suldut treated with Ipguk, whereas, lactic acid was major in Suldut treated with Nuruk in both yeasts. These results suggest that W. anomalus SC-1 showed the possibility for the use of new wild yeast strain as a candidate in simultaneous two-step fermentation for brewing Korean traditional alcohol beverage.



한국전통 누룩에서 분리한 Wickerhamomyces anomalus SC-1의 양조특성

최 진훈, 김 계원1, 이 희윤2, 박 천석2, 심 재용*
국립한경대학교 식품생물공학과 및 글로벌 K푸드 연구센터
1국립한경대학교 양조연구센터
2경희대학교 식품생명공학과

초록


    서 론

    우리나라 전통주류의 제조는 병행복발효 방식의 양조 방 법이 적용되는데 원료로는 곡물과 누룩이 주로 사용된다. 전통누룩의 제조는 무증자 또는 증자 곡물을 분쇄한 다음 자연환경에 분포하는 곰팡이, 효모, 세균 등 다양한 미생물 들이 관여하여 이루어지는 것이 일반적이다. 곰팡이의 생 육에 따라 생성되는 α-amylase, β-amylase, glucoamylase 등과 같은 당화 효소에 의한 전분의 당화와 효모의 알코올 발효로 인한 병행복발효 방식으로 알코올이 생성되는 것으 로 알려져 있다(So, 1995).

    병행복발효 술덧 양조 시 효모 사용에 관한 연구는 효모 의 종류를 달리한 탁주 술덧의 휘발성 향기 성분(Lee et al., 2007), 누룩에서 분리한 효모를 이용한 찹쌀 발효주의 이화학적 특성 및 휘발성 향기 성분(Kim et al., 2009), 효 모 종류를 달리한 탁주 술덧의 품질특성(Lee et al., 2010) 등 많은 연구가 있지만 주로 Saccharomyces cerevisiae를 사용한 연구가 대부분이며, S. cerevisiae 외에 전통누룩에 서 분리한 효모에 대한 연구로는 충청남도 공주 지역에서 수집한 누룩에서 분리한 Pichia anomala Y197-13에 대한 병행복발효 연구 결과가 보고되어 있을 뿐이다(Kim et al., 2012). P. anomala는 현재 Wickerhamomyces anomalus로 속 명이 변경되었고(Kurtzman, 2011) European Safety Authority (EFSA)에 의하여 안전성(Qualitied Presumption of Safety, QPS)이 인정되어 있는 것으로 알려져 있다(Sundh & Melin, 2011). 다양한 소스로부터 분리해낸 W. anomalus의 양조특성에 대한 연구로는 감 등의 과실류에서 분리한 W. anomalus의 감과 사과를 기질로 사용한 발효 시 알코올 생성능과 휘발성 ester 화합물 등에 대한 연구(Kim et al., 2019), 중국 백주 양조 시 사용되는 전통 발효 starter인 Daqu로부터 분리한 W. anomalusS. cerevisiae의 혼합사 용 양조 시 중국 백주의 품질에 큰 영향을 끼치는 ethyl acetate 함량 증가 및 조절에 대한 연구(Fan et al., 2019), 포도 또는 와인에서 분리된 W. anomalus가 와인 양조 시 유해 미생물의 생육 억제 활성, protease와 glucosidase 등 의 효소와 acetate ester 류의 생성 및 S. cerevisiae와의 혼 합 발효에 대한 연구(Padilla et al, 2018) 및 W. anomalus 가 생산하는 glycanase와 glycosidase 등의 효소 가수분해 산물의 와인 품질 개선(Schwentke et al., 2014) 등에 대한 연구 등이 있고, 그 외 과실류 등의 수확 후 변패를 초래 하는 미생물에 대한 억제 활성 및 품질 조절 등에 대한 연구결과가 알려져 있으나 (Platania et al., 2012;Parafati et al., 2015;Grzegorczyk et al., 2017;Contarino et al., 2019) 전통주 발효와 관련한 연구는 보고된 바가 없다. 현 재 유통되고 있는 전통주 대부분은 당화제로 입국과 개량 누룩을 사용하고, 산업용 S. cerevisiae를 알코올 발효에 적 용하는 병행복발효 방식의 획일화된 양조방법으로 제조되 고 있는 상황이므로 중국의 백주와 와인에서와 같이 알코 올 발효에 적용 가능한 새로운 야생효모를 찾아 주질 다양 성 확보 및 이를 통한 차별화된 전통주 제조 가능한 근거 를 마련하는 것이 중요하다.

    본 연구에서는 대한민국 강원도 삼척 지역에서 수집한 누룩에서 새로운 야생효모를 분리·동정하고 이 효모를 사 용하여 병행복발효 술덧의 양조를 실시하여 발효 생성물 profile 및 유기산 조성 분석을 통한 알코올 발효 특성을 조사하여 전통주 제조를 위한 적합성을 확인하고자 하였으 며, 이를 통해 새로운 관능품질의 전통주 제조가 가능할 것으로 생각된다.

    재료 및 방법

    균주 분리

    수집된 전통 누룩(Samcheok, Korea)을 분쇄한 다음 10 g 을 0.1% peptone (Difco) 90 mL에 현탁한 후 단계적으로 10−2-10−7배 희석하고 희석한 현탁액 100 uL씩을 분리용 potato dextrose agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 평 판배지에 도말하여 25°C에서 2일 배양한 다음 단일 균 집 락을 PDA 평판 배지를 사용하여 25°C에서 2일, 2회 계대 배양하여 분리하였다.

    균주 동정

    분리된 균주를 10 mL의 potato dextrose broth (PDB, Difco) 배지에서 2일간 배양한 뒤 filter paper (No. 1, Whatman, Kent, UK)를 통과시켜 균 배양체를 분리하였다. 분리된 균 배양체는 액체 질소를 첨가하여 막자사발을 사 용하여 분쇄하였다. 분쇄액 200 μL에 lysis buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 25 mM EDTA 및 0.5% SDS) 500 μL와 500 μL의 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) 을 첨가하여 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻은 상 층액 600 μL에 3 M의 sodium acetate 60 μL와 isopropyl alcohol 360 μL를 첨가하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분 리하였다. 상층액을 제거한 뒤 침전된 DNA는 500 μL의 70% ethanol을 첨가해 세척한 뒤 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 50°C에서 15분 방치하여 잔존하는 ethanol을 제거하였다. 이후 30 μL의 TE-RNase (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 20 μL RNase, Qiagene, Hiden, Germany)를 첨가한 뒤, 37°C에서 15분 이 상 반응시켜 RNA를 제거하여 genomic DNA를 분리한 다음 ITS1-5.8S rRNA-ITS4 영역을 universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 이용해 증폭 후 증폭 산물에 대하여 0.8% agarose gel을 사용하여 전기 영동을 실시하여 정제하고, Macrogen Co. (Seoul, Korea)에 sequencing을 의뢰하였다. 분석된 염기서열에 대하여 Basic Local Alignment Search Tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/)을 이용하여 동정하였다

    병행복발효 술덧 담금 및 발효

    술덧 담금에 사용한 백미는 흐르는 물에 5번 세미 후 상온에서 약 2시간 정도 물에 침지하고, 30분 동안 물을 뺀 다음 2시간 증미 후 상온에서 냉각시켜 사용하였다. 전분 당화용 발효제로는 시판 입국(Ipguk, Joeun cereal, Hwaseong, Korea)과 개량누룩(Bio-Nuruk, Korea Hyosowon, Hwaseong, Korea)을 사용하였고, 알코올 발효제로는 누룩에 서 분리한 W. anomalus SC-1 배양액과 시판 S. cerevisiae (La parisienne, S.I Lesaffre, Paris, France)를 사용하여 담 금을 실시하였다. 술덧에 사용된 재료의 함량 조건은 다음 의 Table 1과 Table 2에 나타내었다. W. anomalus SC-1 배양액은 PDA 평판 배지에 배양한 W. anomalus SC-1 집 락을 모아 YM 배지 300 mL에 접종 후 교반기(Shaking Incubator, HanBaek Scientific Co., Korea)를 사용하여 30°C 에서 48시간동안 140 rpm의 속도로 교반 배양하여 준비하 였다. 입국을 사용한 담금은 25°C에서 48시간 동안 주모 발효 후 1단 담금을 실시하였고, 1단 담금 후 25°C에서 24시간 동안 발효 후 2단 담금을 실시한 다음 25°C로 품 온을 유지하면서 발효를 실시하였으며, 개량누룩을 사용한 담금은 주모 담금 없이 1단 담금을 실시하고 25°C에서 24 시간 동안 발효 후 2단 담금을 실시한 다음 25°C로 품온 을 유지하면서 발효를 실시하였다.

    발효 생성물 분석

    병행복발효 술덧의 알코올 함량은 주류분석규정(NTS, 2010)에 따라 측정하였다. 술덧을 원심분리하여 얻은 여과 액 100 mL를 메스실린더에 채운 다음 500 mL 삼각플라스 크에 옮기고 30 mL 증류수로 메스실린더에 남은 여과액을 1회 씻은 후 그 액을 여과액이 들어있는 500 mL 삼각플라 스크에 추가로 더 넣어주었다. 그 후 플라스크를 알코올 증류기에 연결시키고 증류액이 냉각되어 나오는 관에 메스 실린더를 연결하여 증류액 80 mL를 받은 다음 100 mL가 될 때까지 증류수로 채운 다음 증류된 용액을 density meter (DMA 35, Anton Paar, Austria)를 사용하여 알코올 함량을 측정하였다. 환원당은 dinitrosalicylic acid (DNS)법 (Chae et al., 2008)을 이용하여 측정하였다. 병행복발효주 술덧을 여과하여 1 mL를 취한 후 DNS 용액을 3 mL를 첨 가하고 100°C에 10-15분간 반응 시킨 다음 증류수 21 mL 를 첨가하여 섞어준 후 분광광도계(Genesys 10-S, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, USA)를 이용하여 550 nm 에서 흡광도를 측정하였고 포도당을 표준당으로 하여 환 원당을 계산하였다. 적정 산도는 국세청 주류분석규정 (NTS, 2010)에 따라 여과된 시료를 정확히 10 mL을 채취 하여 100 mL 삼각플라스크에 넣은 후 혼합지시약(B.T.B & N.R) 2-3 방울 떨어뜨린 다음 0.1 N 수산화나트륨 용 액으로 중화 적정하며 시료의 pH가 6.85-7.0가 될 때까지 적정하면서 0.1 N 수산화나트륨 용액의 소비 mL 수치를 측정하여 산도로 하였다.

    유기산 분석

    Lee et al. (2014)의 연구결과를 참조한 post-column 방 법을 적용하여 HPLC 분석을 실시하였다. 술덧 시료는 0.45 μm membrane filter을 사용하여 여과한 후 SHODEX RSpak KC-811 (8.0 mm ID×300 mm) column을 2개 연결 하여 사용하였으며 oven의 온도는 63°C, flow rate는 0.8 mL/min이었으며, 이동상은 3 mM perchloric acid이었고, injection volume은 10 μL이었다. 분리된 유기산은 reaction coil에서 0.2 mM BTB, 15 mM Na2HPO4, 2 mM NaOH를 사용하여 발색시켰으며, 이때 온도는 25°C, 발색용액의 flow rate는 1.0 mL/min로 하였고, 440 nm에서의 흡광도를 측정하여 검출하였다.

    결과 및 고찰

    균주의 분리 및 동정

    수집한 전통누룩에서 얻은 현탁액을 배지에 도말한 결 과 매끈한 표면의 흰색의 효모 콜로니를 관측하였고 이를 2회 계대배양하여 순수 분리되었음을 고체 배지와 현미경 을 이용하여 확인하였다. 이들 균주들의 양조적성을 확인 하고 그중 가장 적합한 균주를 SC-1으로 명명하였다. 이 후 SC-1균주로부터 DNA를 추출하여 ITS1-5.8S rRNAITS4 영역을 PCR 한 결과 600 bp 가량의 예상된 DNA 단편을 획득하였으며 sequencing된 해당서열을 BLAST 프로그램(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용 하여 비교·분석한 결과 NCBI에 등재된 W. anomalus ATCC 8168 서열과 100% 일치함을 확인하였다. 그리고 NCBI에 등재된 다른 W. anomalus, S. cerevisiae, Candida tropicalis 서열과 SC-1 서열을 MEGA7 프로그램(http:// www.megasoftware.net/)을 이용해 neighbor-joining 계통수를 작성하여 비교한 결과(Fig. 1) SC-1은 다수 W. anomalus의 rRNA 서열과 100% 일치하였으나 S. cerevisiae와는 상이 하였으므로 분리된 SC-1 효모는 W. anomalus인 것으로 동정하였다.

    병행복발효 술덧 중 알코올 함량

    분리·동정한 W. anomalus SC-1과 시판 S. cerevisiae (La parisienne)를 각각 접종하고 발효제로 입국과 개량누룩을 사용하여 최종 발효 후 술덧의 화학적 특성 차이는 Table 3에 나타내었다. 본 실험에서 분리동정한 W. anomalus SC-1을 접종한 술덧의 최종 알코올 함량은 발효제로 입국 과 개량누룩을 사용한 경우 각각 17.8%와 18.9%로 나타 났다. 이와 같은 수치는 시판 S. cerevisiae를 접종하고 발 효제로 각각 입국과 개량누룩을 사용한 최종알코올 함량인 15.1%와 17.6%에 비해 높은 함량을 보였다. 따라서 전통 누룩에서 분리동정한 W. anomalus SC-1은 기존의 시판 효 모와 비교하여도 높은 알코올 발효능을 가지는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 전통누룩만을 사용하는 전통적인 주류 담금에서 S. cerevisiae 외에 다른 종의 효모도 알코올 발 효에 관여함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 발효제로 입국, 전통누룩, 개량누룩을 사용하고, 동일한 누룩에서 분 리한 S. cerevisiaeP. anomala를 접종하여 병행복발효를 수행하여 P. anomala의 알코올 발효능에 대한 선행연구 (Kim et al., 2012) 에서도 확인된 바 있다.

    환원당 함량은 W. anomalus SC-1를 사용하고 발효제로 입국과 개량누룩을 사용한 경우 모두 1.3 mg/mL을 나타내 었고 시판 S. cerevisiae를 사용하고 발효제로 입국과 개량 누룩을 사용한 경우 각각 27.5 mg/mL와 16.5 mg/mL를 나 타내어 발효제의 종류에 상관없이 W. anomalus SC-1가 시 판 S. cerevisiae에 비해 환원당의 소비가 많은 것으로 확 인되며 이는 W. anomalus SC-1에서 높은 알코올 함량을 보이는 결과와 일치하였다.

    유기산 조성과 산도

    발효 종료 후 병행복발효 술덧의 산도는 발효제로 입국 을 사용하고 W. anomalus SC-1와 시판 S. cerevisiae를 접 종한 경우 각각 5.2mL와 4.5mL로 나타났으며, 발효제로 개 량누룩을 사용하고 W. anomalus SC-1와 시판 S. cerevisiae 를 접종한 경우 3.3mL와 3.6mL로 나타났다(Table 3). 사용 효모에 상관없이 발효제로 입국을 사용한 실험군에서 산도 가 높은 결과를 나타냈는데 이와 같은 결과는 산을 고함량 함유하고 있는 입국을 담금 원료로 사용한 결과에 기인하 는 것으로 추정된다(Kim et al., 2016). 발효제로 입국을 사용한 병행복발효 술덧의 경우, W. anomalus SC-1를 접 종한 술덧 중 유기산 함량은 citric acid 2174.6 μg/mL, succinic acid 1361.2 μg/mL, lactic acid 646.8 μg/mL, malic acid 157.5 μg/mL, acetic acid 150.6 μg/mL의 순으로 나타 났고, 시판 S. cerevisiae를 접종한 술덧 중 유기산 함량은 citric acid 2415.7 μg/mL, succinic acid 704.7 μg/mL, lactic acid 606.0 μg/mL, malic acid 396.9 μg/mL, acetic acid 79.2 μg/mL의 순으로 나타났다. 두 가지 효모 모두 생성된 유기산 중 citric acid의 함량이 가장 높았고 생성된 각각의 유기산 함량은 다소 차이가 있었으나 함량순서는 동일한 결과를 나타내었다. 발효제로 개량누룩을 사용한 병행복발 효 술덧의 경우, W. anomalus SC-1를 접종한 술덧 중 유기 산 함량은 lactic acid 2176.3 μg/mL, succinic acid 1323.9 μg/mL, citric acid 369.9 μg/mL, acetic acid 127.9 μg/mL, malic acid 126.4 μg/mL의 순서로 나타났고, 시판 S. cerevisiae를 접종한 술덧 중 유기산 함량은 lactic acid 1447.3 μg/mL, succinic acid 1113.2 μg/mL, citric acid 466.2 μg/mL, malic acid 411.7 μg/mL, acetic acid 311.0 μg/ mL의 순으로 나타났다. 이 경우 입국사용 술덧과는 달리 두 가지 효모 사용에 의해 생성된 유기산 중 lactic acid의 함량이 가장 높았으며 유기산 별 함량순서는 효모에 의한 차이가 없이 동일한 것으로 확인되었다. 따라서 생성된 유 기산의 종류와 함량은 사용된 효모의 차이보다는 발효제의 종류에 주로 의존하며 입국을 사용한 경우 citric acid, 개 량누룩을 사용한 경우 lactic acid가 가장 많이 생성됨을 알 수 있었고 이와 같은 발효제별 유기산 조성의 차이는 기존의 연구 결과(So et al., 1999;Kim et al., 2012)에서 도 확인된 바 있다.

    요 약

    본 연구에서는 산업 현장에서 병행복발효 술덧 양조에 사용되는 입국과 개량누룩을 전분 당화용 발효제로 사용 하고, 대한민국 강원도 삼척 지역에서 수집한 누룩에서 분리·동정한 W. anomalus SC-1을 사용하여 양조를 실시 한 결과, 산업용 알코올 발효 효모 S. cerevisiae 대비 동 등한 알코올 생성능을 보였고 유기산은 두 효모 모두 입 국을 사용한 경우 citric acid, 개량누룩을 사용한 경우 lactic acid가 가장 많이 생성되었다. W. anomalus를 적용 한 와인 및 중국 백주 제조를 위한 술덧의 품질 개선을 위한 다양한 연구 결과가 보고되고 있으므로 우리나라 고 유의 전통주류 양조 기전의 규명과 주질 다양성 확보 및 이를 통한 차별화된 품질의 전통주 제조를 위하여 전통누 룩 중 주요 알코올 발효 미생물로 분리되는 S. cerevisiae 외 야생효모의 알코올 발효 특성과 S. cerevisiae와의 상 호작용에 대한 심화 연구의 필요성에 대한 단서를 제공할 수 있었다.

    감사의 글

    본 연구는 국립한경대학교 연구역량 장학생 지원사업과 환경부 국립생물자원관 (NIBR No. 201629202)의 연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

    Figure

    FOODENGPROG-23-3-223_F1.gif
    Results of BLAST searching of the 5.8S rRNA region sequence of isolated yeast strain from Korean traditional Nuruk.

    Table

    Materials of simultaneous two-step fermentation mash using W. anomalus SC-1 and S. cerevisiae (La parisienne) with Ipguk
    Materials of simultaneous two-step fermentation mash using W. anomalus SC-1 and S. cerevisiae (La parisienne) with Bio-Nuruk
    Chemical characteristics of simultaneous two-step fermentation mash using W. anomalus SC-1 and S. cerevisiae and S. cerevisiae (La parisienne) with Ipguk and Bio-Nuruk

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